透明样本的成像工具-相差（相衬）显微镜

来源:中科院半导体所发布时间:2023-02-082938浏览

来源：锐光凯奇raycage

作者：锐光凯奇raycage

人眼可以看见物体，是因为眼睛中晶状体收集了物体发出的光线并将这些光线汇聚在视网膜上进行了成像，如太阳、电灯和萤火虫等。对于不发光且不透明的物体，通过其表面反射光线成像，物体对不同波长的吸收不同会呈现出不同的颜色。对不发光的透明物体来说，因为与周围介质的折射率存在差异，在两者界面上会产生反射与折射，通过反射光或透射光与背景的差异就看到了物体。在常见的物质中，空气的折射率约为1、水的折射率约为1.33、普通玻璃的折射率为1.5，将玻璃片置于空气中时较容易被看到，而将其放入水中时就较难被看到了，这是由于玻璃片与水的折射率比较接近，光在两者界面产生的反射和折射现象不是很明显，因此不易被观察到。若玻璃片与周围介质的折射率更接近就没办法被看到了。

图1 玻璃片在空气和水中的情况折射率相近导致物体不易被观察到的情况在显微成像中也是经常遇到的问题。显微镜的发明与使用对生命科学的发展具有划时代的意义，若没有它，人类对生物的认识只能停留在人眼可见的水平，不能深入到微观世界，也不能对一些生命现象进行科学解释，更不能对生命现象进行合理利用和干预。在生命科学的研究领域中，想要深入了解细胞、组织或器官内的生命活动过程就需要先对细胞的结构和组织进行深入了解，这些样本多数为无色透明，在明场照明显微镜下很难清晰地观测其微细结构。为了可以看到这些样本的更多细节，科学家们也是煞费苦心。

染色和染料常在生物学和药学领域被用于提高生物组织的可见度，同样，荧光探针标记也具有类似的用途，但是两种方式在进行显微观察时都需要对样本进行预处理，这个过程繁杂且会破坏样本的生理状态。随着需求的日益增加，一种简洁且可研究细胞正常生命周期的相差显微系统就诞生了！

相差显微镜最早是由荷兰物理学家Frits Zernike提出的，它是一种可增强样本与背景对比度的显微成像系统（如图2所示），在不对透明样本进行染色处理的情况下可获得如活细胞、微生物、薄组织切片等透明样本的高对比度图像。

图2 相差显微镜

在介绍相差显微镜的工作原理前先来了解明场显微镜是如何工作的：当照明光通过生物标本时，由于细胞各部位细微结构的折射率和厚度的不同，样本对光的吸收程度不同，在显微镜视场中就可见到明暗度不同的各物点图像，这是由光的振幅不同所致，即相机采集到的是光强信息。但是如果样本中需要观察的物点近乎透明，视场中就看不出明显的灰度差别。但是光波在通过各种物点时会发生衍射和折射，使得通过的光波因延迟而发生了偏离，其光程就有了一定的差别，即产生了所谓“相位差”。人眼不能分辨这种相位差，但可以设法将相位差转换成振幅差。相差显微镜就是利用光的干涉原理，是将相位的微小变化转换成相应振幅变化的显微观察装置。

接下来介绍一下相差显微镜是如何将这种相位变化转换为振幅变化的。图3为常见的使用临界照明方式的明场显微成像光路，平行光束经过聚光镜后会聚于样本平面进行照明，样本各区域对光的吸收程度不同，所以在显微镜视场中可见到明暗度不同的各物点图像。

图3 明场显微成像光路

图6为相差显微系统的基础光路图，与图3进行对比可以发现，相差显微系统的光路就是在临界照明的明场照明显微系统的基础上增加了一个环形的光阑和一个环形的相位板，这两个器件也就是相差显微系统的核心器件。环形光阑的作用是产生中空的环形光，不同的环状孔形成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的，透明圆环所成的像恰好落在物镜后焦面与相板上的共轭面重合；相位板安装在物镜的后焦面处，相位板装有吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜，它除了能推迟直射光线或衍射光的相位以外，还有吸收光使亮度发生变化的作用。

图4 环形光阑和相位板

如图5和图6所示，当入射照明光通过样本后，部分光会发生衍射偏离原来路径（如图5左侧光线所示，图6中绿色区域表示被物镜收集的衍射光），但是大部分的入射光不发生衍射而是沿着原来路径传播（图5中物镜后的橙色区域），未发生衍射的光经过相位环的衰减后在相机上形成平面背景。而偏离原来路径的衍射光在经过相位环后会发生一个90°的相移，经过相移的衍射光和未衍射光最终在相机上形成干涉图样，并将物体的相位信息转化为光强信息记录下来。