技术革命在酝酿—低温电子显微技术时代来临

X射线晶体衍射技术(X-RAY CRYSTALLOGRAPHY)即将成为历史，低温电子显微技术(CRYO-ELECTRON MICROSCOPY)引起了揭示细胞内隐秘机制的革命。

在剑桥大学一幢建筑的地下室里，一场技术革命正在酝酿。

一个笨重的、大约3米高的金属盒子通过连接细胞的橙色缆线，安安静静地传输着以万亿字节计算的数据。这是世界上最先进的低温电子显微镜之一：低温电子显微镜通过电子束对冷冻的生物分子进行成像，从而得到分子的三维结构。站在这个耗资770万美金的仪器旁，英国医学研究委员会分子生物学实验室(UK Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology， LMB)的结构生物学家 Sjors Scheres表示，低温电子显微镜非常敏感，一声喊叫就会带来极大误差，导致实验失败。“英国需要更多低温电子显微镜，因为未来它会成为结构生物学的主流。”

低温电子显微镜震惊了结构生物学。过去30年里，低温电子显微镜揭示了核糖体、膜蛋白和其它关键细胞蛋白的精细结构。这些发现都发表在顶级杂志上。结构生物学家们表示，毫不夸张地说，低温电子显微技术正处于革命之中：低温电子显微镜能够快速生成高分辨率的分子模型，这一点远超X射线晶体衍射等方法。依靠旧方法获得诺奖的实验室也在努力学习这一技术。这种新模型能够准确地揭示细胞运行的必要机制，以及如何靶向针对疾病相关的蛋白。

“低温电子显微镜能够解决很多以前无法解决的谜题。”旧金山加利福利亚大学(University of California)的结构生物学家David Agard这样说道。

几年前Scheres被招进LMB，任务是帮助改进低温电子显微镜，最终他成功了。上个月，他们发表了这个领域最令人振奋的成就：阿兹海默症相关的酶的高清图片，图片包括该酶的1200左右个氨基酸，分辨率达到零点几纳米。

生物学家们如今仍在努力发展该技术，以期用它解决小分子或可变形分子的精微结构——这对低温电子显微镜来说，也是一大挑战。来自加利福利亚大学(University of California)的结构生物学家Eva Nogales表示，叫它革命也好，飞跃也好，低温电子显微镜的确打开了一扇大门。

蛋白结晶

结构生物学领域有一条不成文的观点：结构决定功能。只有知道生物分子的原子排布，研究者们才能了解这个蛋白的功能。例如，核糖体是如何根据mRNA的序列来制造蛋白，分子孔道是如何开和关的。几十年来，分析蛋白结构有一个无冕之王——X射线晶体衍射。在X射线晶体衍射中，科学家们让蛋白结晶，接着利用X射线照射，随后根据X射线的衍射来重建蛋白的结构。在蛋白质数据银行(Protein Data Bank)的100，000多条蛋白词目里，超过90%的蛋白结构是利用X射线晶体衍射技术解析得到的。很多诺贝尔奖也与这一技术相关，例如1962年揭示DNA双链螺旋结构的诺奖。

尽管X射线晶体衍射一直是结构生物学家的最佳工具，但是它有较大的限制。科学家们可能需要几年才能找到把蛋白形成大块结晶的方法。而很多基础蛋白分子，例如嵌在细胞膜上的蛋白，或是形成复合体的蛋白却无法被结晶。

当Richard Henderson 1973年到LMB，研究菌视紫红质(一种利用光把质子运进膜内的蛋白)结构时，X射线晶体衍射是首选工具。Henderson和他的同事Nigel Unwin成功地做出了该蛋白的二维结晶，但却不适用于X射线衍射。因此他们决定使用电子显微镜。

当时，电子显微镜主要用于研究用重金属染过色的病毒或组织切片。一束光子打在样本上，新生的电子被检测到，被用于解析样本结构。这种方法成功制作了第一幅病毒的精微图片——一种烟草病毒。但染色导致无法看清各个蛋白，更不要说原子细节了。Agarad表示，样本上要么满是斑点，要么没染上，你只能看到分子的轮廓。

Herderson等人省略了染色的步骤，把菌视紫红质的单层晶体放到金属网格中，然后用电子显微镜进行成像。Agard表示，这个过程里，你看到的是蛋白的原子。这在当时是很大的进步，因为当时人们都认为不可能利用电子显微镜解析蛋白结构。Henderson等人在1975年发表了这一成果。

20世纪80年代和90年代，低温电子显微镜领域发展迅速。一个关键性突破是利用液态乙烷来快速冷冻蛋白溶液。这也是为什么叫低温电子显微镜的原因。但这个技术的分辨率仅为1纳米，远远达不到针对蛋白结构进行药物设计的需求。而当时X射线晶体衍射的分辨率能达到0.4纳米。NIH等资助者投入了数亿美金来支持蛋白晶体领域的发展，但对于低温电子显微镜领域的资助却很少。

1997年，Henderson参加了高登研究会议(Gordon Research Conference )关于3D电子显微镜的年会。一位同事以这样的话做为开幕致词，“低温电子显微镜技术非常有限，不可能超越X射线晶体衍射。” 但Henderson的想法完全不同，在下一场发言中，他做出了反击。Henderson指出，低温电子显微镜会超越其它各种技术，成为全球研究蛋白结构的主流工具。

革命由此开始

在此之后，Henderson等人致力于提高电子显微镜的性能——尤其是感知电子的灵敏度。在数码相机席卷全球很多年后，很多电子显微镜学家仍然倾向于使用传统的胶片，因为比起数码感应器，胶片能更有效地记录电子。与显微镜生产商合作时，研究者们发明了一种新的直接电子探测器，这种探测器的灵敏度远高于胶片和数码相机探测器。

大约在2012年，这种探测器能够以一分钟几十帧的高速得到单个分子原子的连续图像。同时，和Scheres一样的研究者们精心编写了将多张2D图片建成3D模型的软件程序。这些3D图像的画质可以媲美X射线晶体衍射获得的图像。

低温电子显微镜适用于研究大的、稳定的分子，这些分子能够承受电子的轰击，而不发生变形——由多个蛋白组成的分子机器是最好的样本。因此由RNA紧紧围绕的核糖体是最佳的样本。三位化学家用X射线晶体衍射研究核糖体溶液的工作在2009年获得了诺贝尔化学奖，但这些工作花了几十年。近几年，低温电镜研究者们也陷入了“核糖体热”。多个团队研究了多种生物的核糖体，包括人类核糖体的首个高清模型。X射线晶体衍射的研究成果远远落后于LMB的Venki Ramakrishnan实验室，Venki获得了2009年的诺奖。Venki表示，对于大分子来说，低温电子显微镜远比X射线晶体衍射要实用。

这几年，低温电子显微镜的相关文章有很多：2015年一年，这个技术就用于100多个分子的结构研究。X-射线晶体衍射只能对单个、静态的蛋白晶体成像，但低温电子显微镜能够对蛋白的多种构象进行成像，帮助科学家们推断蛋白的功能。

5月，多伦多大学(University of Toronto)结构生物学家John Rubinstein等人使用了100，000张低温电子显微镜图片来生成V-ATPase 的“分子电影”，V-ATPase的作用是消耗ATP，把质子运进运出细胞液泡。”我们发现，这个酶非常灵活，可以弯折、扭曲和变型。” Rubinstein说道。他认为，这是由于这个酶的灵活性，它能够高效地把ATP 释放的能量传递到质子泵。

2013年Nogales的团队拼接了调控DNA转录成RNA的复合体的结构。他们发现，复合体的一个臂上悬挂着紧绕DNA链的10纳米结构，这段结构可能影响基因转录。Nogales表示，这个结构很漂亮，它可以帮助我们分析这个分子起作用的机制。

小而漂亮

现在低温电镜迅猛发展，专家们正在寻找更大的挑战作为下一个解析目标。对很多人来说，最想解析的是夹在细胞膜内的蛋白。这些蛋白是细胞信号通路中的关键分子，也是比较热门的药物靶标。这些蛋白很难结晶，而低温电子显微镜不大可能对单个蛋白进行成像，这是因为很难从背景噪音中提取这些信号。

这些困难都无法阻挡加利福利亚大学(University of California)的生物物理学家程亦凡。他计划解析一种细小的膜蛋白TRPV1。TRPV1是检测辣椒中引起灼烧感的物质的受体，并与其它痛感蛋白紧密相关。加利福利亚大学病理学家David Julius等人之前尝试结晶TRPV1，结果失败。用低温电子显微镜解析TRPV1项目，一开始进展缓慢。但2013年底，技术进步使得这一项目有了重大突破，他们获得了分辨率为0.34纳米的TRPV1蛋白的结构。该成果的发表对于领域来说，无异于惊雷。因为这证实了低温电子显微镜能够解析小的、重要的分子。“当我看到TRPV1的结构时，我激动得一晚上睡不着觉。”Rubinstein说道。

研究者们可能面临更多这样无眠的夜晚。Agard表示，会有更多膜蛋白相继被解析出来。

上个月由Scheres和清华大学的结构生物学家施一公合作发表的一篇文章就成功解析了一个膜蛋白。他们建立了γ-分泌酶的模型，γ-分泌酶负责合成与阿兹海默症相关的β-淀粉斑。0.34纳米分辨率的图谱显示，比较少见的遗传性阿尔茨海默病的γ-分泌酶突变后会在图谱上呈现两个“热点”(突变或者重组频率显着增加的位点)，并且这种突变最终会合成有毒性的β-淀粉斑。γ-分泌酶的结构图帮助研究者发现为什么以往的抑制剂会无效，从而促进新药的研发。程亦凡表示，γ-分泌酶的结构非常惊人。

类似的成功吸引了制药公司的注意。他们希望借助低温电子显微镜去解析那些无法结晶的蛋白，从而更好地研发药物。Scheres如今和辉瑞公司合作，攻克离子通道。离子通道包含很多膜蛋白，例如痛感受分子和神经递质受体。“我几乎被每一个人联系过。”Nogales这样说道。

尽管低温电子显微镜发展迅速，很多研究者认为，它仍有巨大提升空间。他们希望能制造出更灵敏的电子探测器，以及更好地制备蛋白样本的方法。这样的话，就能够对更小的、更动态的分子进行成像，并且分辨率更高。5月，有研究者发表了一篇细菌蛋白的结构，分辨率达到了0.22纳米。这也显示了低温显微镜的潜力。

与任何热门领域一样，低温电子显微镜的发展也有烦恼。一些专家担心研究者们盲目追求该仪器会诱发一些问题。2013年HIV表面蛋白的结构图遭到了科学家们的质疑，他们认为用于建模的图片很多都是白噪声。此后，其他团队得到的X射线晶体衍射和低温电子显微镜模型也对原模型提出了质疑。但这些研究者们坚持相信自己的结果。今年6月，在高登研究会议(Gordon Research Conference )上，研究者们希望低温电子显微镜的结构图要有严格的质量控制。并且杂志要求作者们提供详细的建模方法。

成本问题可能会限制低温电子显微镜的推广。Scheres估计，LMB每天用于支持低温电子显微镜的经费就达到近3万人民币，外加近1万的电费——这是由于存储和处理图片的电脑耗电量很大。Scheres表示，每天至少要花费近4万人民币，对于很多地方来说，这个费用太高。为了推广低温电子显微镜，很多基金会建立了对外公开的设备，各地研究者们可以预约使用。霍华德·休斯医学研究所(Howard Hughes Medical Institute， HHMI)在珍利亚农场研究园区配备了一台。这台设备对所有HHMI资金的研究者公开。在英国，政府和维康信托在牛津大学附近建立了低温电镜公开使用平台。参与该平台搭建的伦敦大学(University of London)的结构生物学家Helen Saibil表示，有很多人想学习使用低温电镜。

洛克菲勒大学(Rockefeller University)的生物物理学家Rod MacKinnon就是这些人之一。他在2003年因解析一些离子通道的结晶结构而获得诺贝尔奖。MacKinnon现在对低温电镜非常着迷。“我现在处于学习曲线的斜坡阶段，非常热切。” MacKinnon这样说道。他打算用低温电镜来研究离子通道是如何开和关的。

1997年时，Henderson非常坚定地宣称，低温电镜会成为解析蛋白结构的主流工具。在将近20年后的今天，他的预测比当年有了更多底气。 Henderson表示，如果低温电镜保持这样的势头继续发展，技术问题也得以解决，那么低温电镜不仅会成为解析蛋白结构的第一选择，而是主流选择。这个目标已经离我们不远了。