液晶空间光调制器在双光子及三光子显微成像中的应用

摘要

诸如可变形反射镜，液晶空间光调制器(SLM)和柔性聚焦透镜之类的波前成形装置在显微成像领域被广泛的用于像差校正，体积成像和可编程神经元激发。 其中液晶空间光调制器(SLM)是高分辨率的相位调制器，能够创建复杂的相位图，以在三维(3D)体积内可实现任意的光束偏转，可实现三维(3D)体积重塑。

Meadowlark Optics(MLO)公司最新的SLM将面填充率从83.4%提高到96%，并将分辨率从512 x 512像素提高到1920 x 1152像素，同时在1064 nm处达到300 Hz的液晶响应时间(0-2π)和845Hz的帧频，可覆盖波段：850-1650nm。

本文总结了Meadowlark Optics公司新的SLM的功能，以及SLM在双光子及三光子显微微镜成像应用中的优势。

关键词: 高响应速度，高分辨率，高效率，空间光调制器，LCOS, SLM ,液晶空间光调制器，双光子显微镜，三光子显微镜

介绍：

在3D体积中监控和操纵神经元回路的发射模式的需求推动了用于神经科学的高级双光子显微镜的发展。扫描双光子显微镜使用谐振(resonant stages)，或使用声光偏转器光栅扫描建立一个图像。这种方式可实现50 kHz的扫描速率。然而，用这种方法难以实现同时多点刺激，因为激光需要停留在每个位置收集足够的光子以产生可用的图像或调节活动。试图通过增加峰值激发强度来避免这种情况是基本上受到限制的，因为高功率激光会引起神经元的光损伤和荧光团的光漂白。此外，传统显微镜仅限于对二维表面进行成像，而神经回路具有三维结构。深度扫描可用于构建3D图像，但速度非常慢，因为它通常通过以大约20 Hz的速率扫描物镜来实现。这不足以监测在一毫秒的时间尺度上发生的神经活动。对于光遗传学研究，需要能够在3D空间中动态和任意形成多个焦点的显微镜以监视和操纵发射模式，并且显微镜必须能够进行3D成像以捕获神经元电路的响应。

在扫描双光子/三光子显微镜的激发路径中添加液晶空间光调制器(SLM)，可以将激发源分成几百个独立的焦点，并以高达300 Hz的频率重新配置焦点的3D位置。因此，使用SLM可以传递光线，同时可激发多个3D位点的神经元，然后将目标细胞定位在一个体积内以监测神经回路对刺激的反应。这使得在大量细胞群中监测和操纵神经元活动的过程可同步进行。 Yuste首次证明了SLM在光遗传学中的应用潜力，它开发了一种基于SLM的原型显微镜，可以同时激发脑切片中的多个神经元。在那项工作中，Yuste同时在几十个神经元中成像并检测动作电位，帧频为66 Hz。这对于神经科学界来说是一个重大进步，但是当时Yuste可用的SLM限制了这项工作。

这项工作推动了先进的SLMs的发展，以提高分辨率以最大化可研究的大脑的体积，改善功率处理以增加一次可照亮的神经元的数量，并且提高液晶的响应时间，使得激励时间可以匹配神经电路动态过程。Meadowlark Optics(MLO)公司最新的HSP1920型SLM分辨率从512 x 512像素提高到1920 x 1152像素，同时在1064 nm处达到300 Hz的液晶响应时间(0-2π)和845Hz的帧频。

横向/轴向激发

为了使SLM激发一定体积内的神经元，使用SLM作为成像的振幅调制器是不够的。相反，必须将SLM用作相位调制器，并且将所需激励模式的傅立叶变换的全息图写入SLM。使用过渡镜，使SLM成像到物镜的后焦平面。为了利用物镜的全数值孔径(NA)，同时不牺牲激发的限制，物镜处的SLM的图像应该填充后孔。目标SLM图像中像素间距的大小(称为有效像素间距)取决于中继光学系统(如下图)。

激发的横向视场由可写入SLM的最小相位光栅控制。根据光栅方程sin(θ)= m *λ/ d，可以计算出光线可以偏转的最大角度。这取决于设定的阶数m，波长λ和光栅d的周期，其最小值为有效像素间距的2倍。通过物镜的焦距将测向角度转换为样品的横向位移。下图为用1920x1152液晶空间光调制器在1064nm实现了0度，0.2度，0.4度，0.8度，1.6度的光束偏转。

通过将SLM的分辨率从512 x 512提高到1920 x 1152像素，消除了激励约束与视场之间的限制。对于光遗传学来说，希望维持x和y中激发的点扩散函数(PSF)，因此将SLM的正方形感兴趣区域成像到物镜的后焦平面，有效地将SLM分辨率降低到1152×1152像素。 SLM的像素间距为9.2微米，使得SLM的短轴为10.6毫米。为了使SLM图像的尺寸与物镜的后孔径相匹配，中继光学器件必须将SLM的图像放大，从而将有效像素间距减小到8μm。在0，π衍射图中，最大光栅周期为2个像素，入射波长为940 nm，SLM可以转向的最大角度为3.36°。取物镜焦距为7.2 mm，最大横向位移为零点附近±423μm，或x和y的总横向位移为847μm。这超出了目标可以成像的视野，同时保持目标的全部NA，因此不会牺牲激励约束。此外，通过傅里叶变换，现在可以在样本上创建1152 x 1152个焦点，这只能将目标可解析的焦点利用不到1.16倍。

表1总结了1920 x 1152像素SLM和512 x 512像素SLM的客观规格，光学系统，侧向光束传输规格，其中SLM的图像与SLM的图像与目标后光圈的尺寸以及客观利用率相匹配。 可以使用概述的方程针对不同的SLM模型复制分析。

表1. SLM分辨率与客观规格，中继光学系统的选择以及波长相结合，决定了SLM可以使光线转向的横向视场的规格。 该表比较了当将SLM的图像与物镜的后孔径相匹配时的512×512像素SLM，当将SLM的图像填充到物镜上以牺牲激励约束以匹配转向指向的视场时 目标，1920 x 1152 1152 x 1152像素图像中继到目标。 高分辨率SLM将SLM的射束导向能力与目标视野相匹配，而不会牺牲激励约束。

表2总结了光学系统，1920 x 1152像素SLM和512 x 512像素SLM的光学系统，轴向光束转向规格，其中SLM的图像与物镜后孔径的尺寸相匹配。

表2. SLM分辨率加上客观规格，中继光学元件的选择和波长决定了焦距从客观设计焦距的最大轴向位移的规格。 该表比较了当将SLM的图像与物镜的后孔相匹配时的512×512像素SLM，当SLM在物镜上的图像填充不足时，以及1920×1152，其中1152×1152像素图像是 转达到目标。

损伤阈值

随着激励视野的增加，可以研究更多的神经元和更大的神经回路。为了照亮视野中的多个物体，SLM将入射照明分为多个焦点。随着焦点数量的增加，每个焦点的功率下降。为了增加激发目标的数量，同时保持每个目标足够的功率以激发荧光，SLM的功率处理变得至关重要。多个因素影响功率处理。增加SLM的尺寸允许照明分布在更大的区域，涂层可以被优化以限制吸收，并且主动和被动冷却系统可以用于缓解热效应。

对于光遗传学，许多研究人员正在使用飞秒脉冲激光器。 Coherent Monaco是一款1035 nm脉冲激光器，可编程脉冲宽度范围从300飞秒(FWHM，sech2 fit)到10皮秒。它具有40 uJ的最大脉冲能量，并且在1 MHz的脉冲重复频率下，激光器可输出40 W的平均功率。通过将入射光功率从101 MW / cm2增加到729 MW / cm2对1920 x 1152 SLM(型号：HSP1920-1064-HSP8)的损伤阈值进行测试，同时在向SLM写入一系列衍射图时测量背板温度和一阶衍射效率。当使用被动冷却系统时，由于随着入射功率增加，背板温度增加22°C，观察到调制深度的变化。然而，在最大入射功率下，调制深度仍然大于一个波，允许基于温度表征光学响应的​​能力，并且使用片上传感器作为闭环系统来保持与入射功率无关的一阶衍射效率。或者，可以将有源冷却块添加到SLM，以维持低于40°C的工作温度，从而保持一致的调制深度而与入射功率无关。

激光参数：1MHz重复频率，280 fs脉冲宽度，6.7mm光束尺寸(1 / e2)。 最大输出功率36uJ，平均功率36W，平均功率密度= 204W / cm2，峰值功率= 128MW，峰值功率密度= 729MW / cm2。 (左)由于被动冷却系统的热效应，入射功率增加时调制深度减小(右)增加主动冷却系统允许在峰值功率密度高达729MW / cm2的情况下保持一致的调制深度。

响应时间

液晶响应时间取决于多个因素，包括液晶层的厚度，其被优化后在最长工作波长处提供一个相位行程波，驱动器的电压和液晶材料特性。 对于光遗传学，大多数研究人员将SLM与双光子、三光子显微镜结合，并且工作在900 nm至1300 nm的波长范围内。 MLO是唯一提供高速SLM的供应商，HSP1920-1064型液晶空间光调制器在1064 nm，能够达到300 Hz的液晶响应速度(从0 - 2pi转换)和845Hz的帧频(灰度图片同电脑传输到SLM速度)。

在1064 nm处，液晶从10%到90%范围内上升和下降时间小于3 ms。将焦点通过触发打开和触发关闭进行检测。 (左)由软件定时驱动的液晶开关。 焦点被打开和关闭探测器(显示为黄色)。 当SLM上的图像发生变化时，硬件会产生一个输出脉冲(以紫色显示)，表示新图像将在1.18 ms内开始在SLM上加载。 (右)由外部硬件触发驱动的液晶开关。 当外部触发器的下降沿到达(以蓝色显示)时，硬件将启动SLM上的图像更新。 产生输出脉冲以确认接收到触发(以紫色显示)。 在产生输出脉冲后的1.18面试内，图像将在SLM上更新(以黄色显示，焦点移入和移出检测器)。

相位稳定性

为了确保激励源在许多神经元之间分配时的一致激励，SLM的时间特性变得重要。 MLO SLM使用两种策略来最大化相位稳定性。第一种策略是使用直接模拟寻址，而不是模拟使用二进制寻址与时序抖动相结合的模拟调制。第二种策略是使用能够以844Hz的速率刷新的定制背板。高速背板刷新对于减轻像素电容的电压损失是必要的。如果背板刷新较慢，则像素处的电压下降使液晶分子松弛，从而改变LC的折射率。如果背板电压的刷新速度明显快于LC弛豫时间，那么SLM将具有较高的相位稳定性。

通过向SLM写入重复相位斜坡并测量一阶强度来量化相稳定性。 LC分子松弛的不稳定性会导致一阶焦点的强度随时间而变化。相稳定性被定义为峰到一阶焦点强度的峰值与平均焦点强度的比值。对于具有ODP的512 x 512像素SLM，相位纹波为3% - 5%，对于高速1920 x 1152像素SLM，相位纹波为2% - 4%(图6)。对于需要更高相位稳定性和高分辨率的研究，标准的1920 x 1152像素SLM可提供低至0.20%的相位纹波。

波前质量(波前畸变)

单光子激发相比，双光子激发具有更好的限制，因为由两个光子同时激发的可能性与光强度的平方成正比。因此，双光子激发以焦点距离的四次幂衰减[8]。然而，这种低激发的可能性使得操作模式对改变焦点的PSF的像差敏感。为了确保在大体积上的一致激发，校正显微镜中SLM和其余光学元件的像差是很重要的。

许多用于表征和校正像差的算法都基于Zernike多项式。然而，对圆形孔径的依赖不适用于描述正方形或矩形阵列的像差。已经开发了基于SLM的干涉子孔径的替代策略[9]，以确保SLM的有效区域上的像差可以被校正到λ/ 40或更好。如图7所示，由于使用了制造工艺，MLO SLM的本地波前像差很低。残留误差被去除以确保神经元激发的衍射受限焦点。

(a)原始的1920 x 1152像素SLM波前(λ/ 7 RMS)(b)应用了像差校正的波前(λ/ 20 RMS)(c)未应用校正的像差曲面图。 (c)应用校正后的像差曲面图。

神经元激发效率

光遗传学的目标是了解神经回路的功能，以及发射模式和行为之间的关系。为了获得成功，科学家需要能够监测和操纵尽可能多的神经元，并以与自然发生的电路动力学相匹配的速率复制发射模式。有许多因素决定每秒可处理多少神经元，其中一些取决于实验，另一些取决于光学系统的极限。例如，当针对皮质深处的神经元时，由于散射造成的损失是显着的。由于存在激光功率会导致热损伤的阈值，因此不能简单地增加入射功率以适应散射损失。在这种情况下，皮层所需层的有限功率将决定可被激发的神经元的数量。然而，假设一位研究人员试图将神经元定位在皮层的相同位置，SLM的规格也将决定每秒可以定位的神经元的数量。HSP1920-1064空间光调制器较原来的ODP512SLM在神经元激活的速度方面提高了将近一倍。